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Los oligonucleótidos se utilizan en numerosas aplicaciones científicas, desde la investigación biomédica hasta el desarrollo de fármacos. En todas ellas para que los oligonucleótidos sean efectivos es esencial que estén libres de impurezas.
La purificación de oligonucleótidos es, por tanto, un paso crítico en su fabricación. Es lo que se conoce como downstream process dentro del proceso de producción. A continuación, exploramos las principales técnicas utilizadas para este propósito y su importancia en el campo de la biotecnología y la medicina.
Principales técnicas de purificación de oligonucleótidos
1. HPLC (High-Performance Liquid Chromatography)
RP-HPLC (Reversed-Phase HPLC): Esta técnica separa los oligonucleótidos de menos de 50 bases de longitud basándose en sus propiedades hidrofóbicas. Es muy eficaz para purificar tanto oligonucleótidos modificados como no modificados. Su alta precisión (pureza del 90-95%) la convierte en una de las técnicas más utilizadas en la purificación de oligos.
AEX-HPLC (Anion Exchange HPLC): Utiliza interacciones de carga para separar los oligonucleótidos según su longitud y carga. Esta técnica es ideal para obtener una alta resolución en la purificación de oligonucleótidos de diferentes longitudes.
La cromatografía líquida a alta velocidad (FPLC) es la técnica más utilizada ya que combina el uso de columnas cromatográficas de diversos tipos como l afiltración en gel, interacción hidrofóbica, intercambio iónico y afinidad las cuales se conectan a un equipo automatizado equipado con un detector de luz UV-visible (190-700 nm) en línea con hasta tres longitudes de onda simultáneas (e.g. 280/214/254 nm), un medidor de conductividad (0.001-999.9 mS/cm), un mezclador de gradientes y un monitor de pH en línea.
2. PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
PAGE es una técnica que ofrece una alta resolución en la separación de oligonucleótidos basándose en su tamaño. Es especialmente útil cuando se necesita separar varios oligonucleótidos más largos (de más de 50 bases) con diferencias en su secuencia. Aunque puede ser laboriosa, su precisión es inigualable (95-99 % de pureza).
Otras Técnicas de Purificación
Además de las técnicas mencionadas existen otros métodos para purificar oligonucleótidos, como la desalado por columnas de exclusión por tamaño (SEC), que separa moléculas basándose en su tamaño, la ultrafiltración y la purificación por fase sólida (SPE), que retiene oligonucleótidos mientras se lavan las impurezas. También se utilizan técnicas como el fosfato de celulosa, que emplea interacciones de carga para la separación. Cada técnica tiene sus propias ventajas y se elige en función de las características específicas del oligonucleótido y las impurezas presentes.
La purificación de oligonucleótidos es esencial en el desarrollo de fármacos y terapias en la medicina personalizada. La precisión y eficacia de las técnicas de purificación determinan la calidad y funcionalidad de los oligonucleótidos, impactando directamente en la capacidad de desarrollar tratamientos personalizados para enfermedades complejas. Con el avance continuo de la biotecnología, la optimización de estas técnicas es fundamental para la mejora de la salud global.
Fuentes:
Consejos para elegir correctamente la purificación de sondas y oligos
Best Oligonucleotide Purification Methods for Your Research | Thermo Fisher Scientific – ES
Imágenes: